22.10.2020

Исследователи используют CRISPR для ускорения поиска лекарств от ВИЧ

hiv
                ВИЧ заражает клетки человека. Кредит: NIH

Исследователи из Калифорнийского университета в Сан-Франциско и академических институтов Гладстона использовали недавно разработанную систему редактирования генов, чтобы найти генные мутации, которые делают иммунные клетки человека устойчивыми к ВИЧ-инфекции.
                                                                                       

Команда создала высокопроизводительную платформу для редактирования ячеек с использованием варианта технологии CRISPR/Cas9, которая позволила им проверить, насколько хорошо различные генетические изменения защищают иммунные клетки от ВИЧ. Новая система позволяет исследователям быстро модифицировать генетический код недавно пожертвованных человеческих иммунных клеток и, надеемся, ускорит поиск окончательного лечения пациентов с ВИЧ +, считают исследователи.

«Это способность, которую исследователи ВИЧ давно хотели», — говорит доктор наук Джудд Ф. Хультквист, один из соавторов новой статьи. «Я надеюсь, что год назад это будет казаться непреодолимой задачей, и каждый сможет это сделать».

Исследование, которое было опубликовано в сети 25 октября 2016 года в Cell Reports, было проведено лабораториями соавторов авторов Невана Дж. Крогана, доктора философии, профессора клеточной и молекулярной фармакологии в UCSF, директор Института количественных биологических наук (QBI) в Фармацевтической школе UCSF, старший научный сотрудник в Институтах Гладстона и Александр Марсон, доктор медицинских наук, доцент кафедры микробиологии и иммунологии в Медицинской школе UCSF. Исследование было инициировано Хультквистом, который находится в лаборатории Крогана, и Кэтрин Шуман, доктор наук, постдокторский исследователь в лаборатории Марсона.

Редактирование генов предлагает возможность излечения от ВИЧ

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый с 1980-х годов в способности лечить и контролировать ВИЧ с помощью антиретровирусных препаратов, все еще нет лекарства от вируса, и миллионы людей заражаются ежегодно. Как только вирус проникает в иммунную систему пациента, он может бесконечно прятаться в собственной ДНК клетки, которую невозможно обнаружить или уничтожить с помощью современных технологий. В результате пациенты должны продолжать принимать антиретровирусные препараты до конца своей жизни.

Однако не все подвержены вирусу. Ученые черпали вдохновение в группе людей, чьи иммунные клетки, по-видимому, естественным образом устойчивы к ВИЧ-инфекции, и надеются однажды отредактировать иммунную систему пациентов с ВИЧ, чтобы имитировать биологию этих ВИЧ-устойчивых людей.

«Было предпринято много попыток упорядочить геномы резистентных людей, чтобы обнаружить мутации, которые делают их невосприимчивыми к вирусу», — сказал Хультквист. «Но есть много разных генов, которые могут быть вовлечены: одни контролируют способность вируса проникать в иммунные клетки, другие контролируют, как вирус обманывает клетки в экспрессии своих генов. До сих пор не было никакого способа проверить, какие из этих мутаций действительно обеспечивают устойчивость». в первичных Т-клетках человека. «

Платформа на основе CRISPR направлена ​​на ускорение поиска лекарств

Несмотря на то, что они являются ведущими бойцами иммунной системы, Т-клетки деликатны — способны выживать вне организма только пару недель. Они также устойчивы к вирусам, которые исследователи используют в клетках других типов для предоставления ДНК-инструкций о том, как создать механизм, необходимый для редактирования генов CRISPR/Cas9. В прошлом году Марсон и Шуман успешно использовали CRISPR, чтобы впервые выполнить точную замену последовательности ДНК в первичных Т-клетках человека, предварительно изготовив механизм CRISPR в пробирках, а затем добавив его к свежеприготовленным иммунным клеткам.

«Это невероятно быстро», — сказал Шуман. «Требуемое редактирование происходит быстро, а затем ячейка ухудшает механизм CRISPR, поэтому она не может продолжать вносить изменения. Это действительно важно: в противном случае это все равно, что делать операцию и оставлять в скальпеле».

В новой статье Шуман и Хультквист усовершенствовали эту технику, разработав автоматизированную систему параллельного редактирования Т-ячеек с высокой пропускной способностью. Новый подход позволяет исследователям мутировать различные гены-кандидаты в сотнях тысяч Т-клеток от здоровых добровольцев, подвергать эти мутантные клетки воздействию вируса ВИЧ, а затем проводить скрининг через клетки, чтобы определить, какие мутации смогли предотвратить инфекцию.

Ключевой особенностью этой системы является ее скорость, поскольку донорские Т-клетки могут выживать только вне организма в течение двух-трех недель. «Если мы хотим начать редактирование Т-клеток и возвращать их людям в качестве терапии, — сказал Кроган, — я думаю, что это будет золотой стандарт того, как сделать это быстро, безопасно и эффективно».

Исследователи использовали новую технику для мутирования генов CXCR4 и CCR5, которые кодируют молекулы рецептора, которые используются различными штаммами вируса ВИЧ для проникновения и заражения иммунных клеток и которые были целью в предыдущих испытаниях клеточной терапии. Инактивация любого из этих генов успешно блокировала заражение ВИЧ Т-клеток человека соответствующим штаммом ВИЧ.

Дополнительные эксперименты показали возможность создания двухслойной системы безопасности для Т-клеток путем одновременной блокировки гена, необходимого вирусу ВИЧ для проникновения в клетки, и гена, необходимого вирусу для выживания и размножения в клетке, что приводит к двойному надежное сопротивление.

Чтобы продемонстрировать эффективность и мощь новой высокопроизводительной технологии, исследователи также разработали 146 различных правок на основе CRISPR, каждое из которых предназначено для деактивации одного из 45 генов, связанных со способностью ВИЧ интегрироваться в клетки-хозяева. Они идентифицировали несколько генов, отсутствие которых придает устойчивость к ВИЧ, некоторые из которых были предсказаны в предыдущих исследованиях, а другие никогда ранее не были напрямую связаны с ВИЧ-инфекцией.

«Верхушка айсберга» для исследования инфекционных заболеваний

Исследователи планируют использовать новую платформу для выявления дополнительных слабых сторон в жизненном цикле вируса ВИЧ, которые могут быть использованы либо клеточной терапией, либо целевыми препаратами. Они также хотят иметь возможность вводить более тонкие мутации, такие как мутации, обнаруженные у ВИЧ-резистентных индивидуумов, которые могут изменить клеточную функцию настолько, чтобы вызвать резистентность, но без полной дезактивации гена и нарушения функции клетки.

Тем не менее, их большая надежда состоит в том, что система будет иметь более широкие возможности, чем просто ВИЧ, и в конечном итоге будет использоваться в лабораториях по всему миру для изучения вируса по своему выбору.

«Этот инструментарий был огромным недостатком в исследованиях инфекционных заболеваний», — сказал Марсон. «Теперь у нас есть возможность вносить изменения в человеческие иммунные клетки и сразу же увидеть результаты. Потенциал огромен — это только верхушка айсберга».

Дополнительные авторы новой статьи включают Джонатана М. Ву, MS, из UCSF; Майкл Дж. Макгрегор, магистр естественных наук, UCSF и институты Гладстона; Лара Манганаро, доктор философии, и Вивиана Саймон, доктор медицины, доктор философии, Mt. Синайская медицинская школа Икан; и Дженнифер Дудна, доктор философии, из Калифорнийского университета в Беркли и Медицинского института Говарда Хьюза. Кроган является директором сайта UCSF Калифорнийского института количественных биологических наук (QB3). Марсон является членом Отдела инфекционных заболеваний и ревматологии медицинского факультета UCSF, Диабетического центра UCSF и Центра лечения рака в семье Хелен Диллер. Марсон и Дудна являются членами Инициативы по инновационной геномике Калифорнийского университета.

Marson подал патент на использование RNP Cas9 для редактирования генома первичных Т-клеток человека и является консультантом Juno Therapeutics независимо от этой работы ./p>

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *